Grūsnības noteikšana laboratorijā piena un asins paraugos Dita Krastiņa SIA Piensaimnieku laboratorija, Ulbrokā
Kā sauc šo laboratorijā izmantojamo grūsnības noteikšanas metodi? ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) imūnfermentatīvā analīze
Kas nepieciešams ELISA izpildei? diagnostiskie reaģenti (pienam «IDEXX Milk Pregnancy kit», asinīm «IDEXX Pregnancy kit») labas kvalitātes dejonizēts ūdens automātiskās pipetes, pipešu uzgaļi iekārtas - mikroplašu inkubators (šeikeris), mikroplašu mazgātājs, rezultātu nolasītājs (spektrofotometrs) utt.
Kāds ir šīs metodes pamatojums? Nosaka grūsnības specifiskos glikoproteīnus (PAG pregancy-associated glycoproteins) Tie veidojas atgremotāju placentas kotiledonu šūnās, pēc tam tie nonāk asinīs un arī pienā PAG konstatēšana asinīs/pienā apstiprina grūsnību
Kāda ir un no kā ir atkarīga PAG koncentrācija asinīs/pienā? Grūsnības laika (PAG līmenis palielinās pēc 25.gr.dienas, sasniedzot pirmo kulmināciju ap 32.gr.dienu. Tad to līmenis samazinās un laikā starp 46.- 67.gr.dienu pienā un 53.-60.gr.dienu asinīs ir salīdzinoši zems. Taču pēc tam atkal PAG koncentrācija būtiski palielinās. Dažas nedēļas pirms dzemdībām PAG koncentrācija ir visaugstākā Tele vai vecāka govs (telei pirmajā grūsnībā PAG koncentrācija asinīs/pienā būs augstāka) Agrīna embriju nāve (skatīt nākošo slaidu) Izslaukums (pie lielāka izslaukuma PAG koncentrācija ir mazāka, jo pienīgāka govs agrīnā attīstībā teliņu audzē lēnāk)
Kas saistībā ar šo metodi jāzina par agrīno embriju nāvi / abortiem? Grūsnības pirmajās 60 dienās embriju agrīnās nāves gadījumi var būt pat 15% dzīvnieku. Pēc 60.grūsnības dienas abortu risks samazinās uz 2-4% (Santos et al., 2004), taču arī pēc 151.grūsnības dienas abortu skaits var sasniegt 1,3% (Norman et al., 2012). Pēc agrīnā aborta PAG izzūd apmēram 7 dienu laikā, tāpēc atkārtotu paraugu nevajadzētu izmeklēt ātrāk kā pēc 1-2 nedēļām. Agrīna embrija nāve Vēlīna embrija nāve Agrīna augļa nāve Vēlīna augļa nāve Aborts (Ab) 1.-16.gr.diena 16.-42.gr.diena 42.-90.gr.diena 90.-150.gr.diena >150.gr.diena
Kādā grūsnības periodā var izmantot šo metodi? no 28.dienas pēc pēdējās apsēklošanas vai aplecināšanas Ja ātrāk iespējams viltus negrūsns rezultāts līdz atnešanās brīdim. Optimāli ap 32.dienu un pēc 74.dienas - (laikā no 39. līdz 67.dienai ir samazināts PAG līmenis) ne ātrāk kā 60 dienas pēc pēdējās atnešanās Ja to neievēro iespējams viltus grūsns rezultāts, jo asinīs/pienā var būt PAG no iepriekšējās grūsnības Grūsnības laikā PAG līmenis nedaudz svārstās, taču to līmenis nenokritīs zemāk par grūsnības noteikšanas robežu jeb t.s. cut-off.
Kādus paraugus var sūtīt izmeklēšanai? Grūsnības izmeklējumus var veikt: Ø govīm, kazām piena paraugos - gan nekonservētā, gan konservētā piena paraugā. Piena paraugus var ņemt speciāli grūsnības izmeklēšanai, bet var arī izmantot piena pārraudzības analīzēm ņemtos paraugus, tikai pēdējā gadījumā ļoti rūpīgi jāseko pareizai paraugu noņemšanai un marķēšanai. Ø govīm, kazām un aitām asins paraugos asinis noņem asins stobriņos bez stabilizatora (vakuumstobriņi ar sarkanu korķi) un laboratorijā izmeklējumus veic asins serumā. Govīm izmeklēšanai var izmantot arī asins plazmu, tātad asinis var ņemt arī stobriņos ar stabilizatoru (visbiežāk EDTA jeb vakuumstobriņi ar violetajiem korķiem). Asinis Priekšrocības pilnībā izslēgta kontaminācija no dzīvnieka dzīvniekam PAG līmenis (koncentrācija) asinīs ir nedaudz lielāks nekā pienā, līdz ar to rezultāts ir pārliecinošāks Piens viegli iegūstams paraugs govij neradām lieku stresu Trūkumi grūtāk paņemt, nepieciešama veterinārārsta palīdzība dzīvniekam lielāks stress sevišķi izmantojot piena pārraudzības izmeklējumiem domātos piena paraugus, jāizsver paraugu kontaminācijas risks ar izslaukuma mērīšanas traukiem
Kādi nosacījumi jāievēro, noņemot paraugus? ASINIS - no vēnas vakuumstobriņos: - bez stabilizatora (ar sarkaniem korķiem) tad laboratorijā izmeklējumus veiks asins serumā. Sākumā paraugus ~ 1 stundu patur telpas temperatūrā (ļaujot asinīm sarecēt), tad ievieto ledusskapī - ar stabilizatoru (piemēram, EDTA ar violetiem korķiem) tad laboratorijā izmeklējumus veiks asins plazmā. Stobriņš pēc asiņu noņemšanas vairākas reizes jāsamaisa. PIENS speciālajos piena trauciņos. ü Noslauc pirmās piena strūklas un paņem pienu paraugam. ü Nav nozīme slaukšanas reizei (rīta, vakara), tesmens ceturksnim (no kura pupa), slaukšanas sākumā vai beigās. ü Piena paraugu var ņemt speciāli grūsnības izmeklējumiem, bet var izmantot arī vienu paraugu gan pārraudzības, gan grūsnības izmeklējumiem. ü Piena paraugi var būt arī nekonservēti, bet labāk tos konservēt ar BSM (Broad Spectrum Microtabs) tabletēm. Konservants aizkavē piena bojāšanās un saskābšanas procesus, kas īpaši svarīgi vasarā. Pēc parauga noņemšanas piens trauciņā ir jāsamaisa, līdz tablete pilnībā izšķīst (piens nokrāsojas oranžs). ü Nevajadzētu uz laboratoriju sūtīt piena paraugus no govīm ar klīnisko mastītu. Gan asins, gan piena paraugi pēc noņemšanas jāglabā +2+12 o C temperatūrā un pēc iespējas ātrāk jānogādā laboratorijā.
Kāda ir šīs metodes rezultātu ticamība? Atkarīga no metodes/diagnostisko reaģentu: Jutības (sensitivity) (patiesībā grūsnām govīm izmeklēšanas rezultāts «GRŪSNA») Specifiskuma (specificity) (patiesībā negrūsnām govīm izmeklēšanas rezultāts «negrūsna») Izmeklējamie paraugi jutība specifiskums ASINS paraugi 99,2% 94,5% PIENA paraugi 98,7% 94,4% No tā izriet, ka 98,7% grūsnas govis ar attiecīgo testu piena paraugos uzrādīs rezultātu grūsna (1,3% sagaidāms rezultāts - viltus negrūsna ) un savukārt 94,4% negrūsnas govis ar attiecīgo testu uzrādīs rezultātu negrūsna (5,6% sagaidāms rezultāts - viltus grūsna )
Kā testēšanas pārskatā izskatīties izmeklējumu rezultāti? ASINS paraugiem - GRŪSNA - negrūsna PIENA paraugiem - GRŪSNA - negrūsna - «Rezultāta precizēšanai vēlams iesūtīt atkārtotu paraugu pēc 1-2 nedēļām. Taču, ja ir pagājušas vairāk kā 45 dienas pēc pēdējās apsēklošanas, rezultātu saskaņā ar diagnostisko reaģentu ražotāja (IDEXX) validāciju var interpretēt kā grūsna». Šāds rezultāts tiek prognozēts ~ 3-4% no izmeklētajiem paraugiem. Ja atkārtotais paraugs būs negatīvs, tad tas ļoti iespējams bijis agrīnās embrionālās nāves gadījums.
Kāda ir 1 parauga izmeklēšanas cena SIA Piensaimnieku laboratorijā? Vienāda gan asins, gan piena paraugu izmeklēšanai. Vienā reizē iesūtīto paraugu skaits Cena bez PVN Cena ar 21%PVN 1-20 paraugi 3,66 4,43 >20 paraugi 3,25 3,93
www.pienslabs.lv Paldies par uzmanību!